植物中富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也含有大量次生代謝產(chǎn)物。其在藥品、香料、染料、色素、殺蟲劑、食品添加劑等領(lǐng)域具有悠久的應(yīng)用歷史[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，植物資源己經(jīng)成為人類賴以生存的食物與藥品的重要資源之一。植物次生代謝產(chǎn)物是植物體中存在的一大類非生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，但在植物抗逆及抵御病蟲害等方面發(fā)揮著重要作用。

目前已報(bào)道的植物次生代謝產(chǎn)物主要包括生物堿、黃酮類、醛類、木脂素等，其種類達(dá)到數(shù)萬(wàn)種以上。目前，部分次級(jí)代謝產(chǎn)物已被開發(fā)成商業(yè)化產(chǎn)品，具有廣闊的社會(huì)需求與重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，青蒿素被用于痢疾的治療，紫草素用于抗菌，香蘭醛、玫瑰油用作香料，除蟲菊素、苦參堿、藜蘆堿用作殺蟲劑，蛇床子素、香芹酚、小檗堿等已被廣泛用于農(nóng)業(yè)病害的防治。

隨著對(duì)新品類藥用植物的研究以及先進(jìn)技術(shù)的投入，越來(lái)越多的具有高生物活性的新型藥用植物次生代謝產(chǎn)物相繼被發(fā)現(xiàn)，對(duì)植物資源的需求正不斷增加。除野生采集外，藥用植物的人工栽培仍是目前提供原材料的主要途徑。人工栽培對(duì)植物種子、土壤、氣候條件等要求較高，栽培過(guò)程中易感染病害、部分藥用植物栽培時(shí)間長(zhǎng)、管理成本高。同時(shí)，藥用植物栽培與農(nóng)作物栽培的爭(zhēng)地矛盾日益突出[1]，高活性植物次生代謝產(chǎn)物供需關(guān)系緊張[2]。

而利用植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)生成的植物單細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模集中離體飼喂，以大量獲得高活性目標(biāo)代謝產(chǎn)物是目前解決藥用植物資源問(wèn)題的有效途徑。

一、植物干細(xì)胞概念及發(fā)展

植物組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)開始于19世紀(jì)后半葉，在Schleiden和Schwann創(chuàng)立的細(xì)胞學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)上，1902年德國(guó)植物生理學(xué)家Habedandt提出了著名的″植物干細(xì)胞全能性″論點(diǎn)[3]，認(rèn)為植物干細(xì)胞具有在體外發(fā)育成完整植株的能力。但直到1934年，White[4]使用離體的番茄根部建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性系，才使根的離體培養(yǎng)試驗(yàn)首次獲得了真正的成功。二十三年后，Skoog和Miller[5]發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)素可以有效地促進(jìn)外植體的細(xì)胞分裂和芽再生。其中最重要的是，高激動(dòng)素/生長(zhǎng)素比例誘導(dǎo)芽的發(fā)生而低激動(dòng)素/生長(zhǎng)素比例促進(jìn)根的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)奠定了植物組織培養(yǎng)中再生和細(xì)胞工程的基礎(chǔ)，揭開了激素調(diào)控植物器官再生的秘密面紗。Muir等人[6]利用萬(wàn)壽菊愈傷組織建立了首個(gè)植物干細(xì)胞懸浮系。他們通過(guò)愈傷組織哺育方法成功地觀察到單個(gè)細(xì)胞可以分裂形成小的細(xì)胞團(tuán)。1958年，Steward等人[7]將胡蘿卜根韌皮部的細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞失去已分化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征并發(fā)生反復(fù)的細(xì)胞分裂，最終形成胚胎并發(fā)育成具有根、莖、葉等器官的完整植株。同年，德國(guó)科學(xué)家Reinert[8-9]也獲得了類似的研究結(jié)果。此后，經(jīng)過(guò)研究人員50余年的不斷驗(yàn)證，植物干細(xì)胞的全能性已經(jīng)得到充分驗(yàn)證。

圖1. 不同品種的植物干細(xì)胞

二、植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)

與常規(guī)的栽培技術(shù)相比，植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行藥用植物目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有顯著的優(yōu)越性。[10]與栽培植物不同，植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)使用工業(yè)化反應(yīng)器生產(chǎn)系統(tǒng)及配套回收工藝，在自動(dòng)控制系統(tǒng)的加持下，可實(shí)現(xiàn)全年不間斷運(yùn)轉(zhuǎn)。不受土壤環(huán)境、氣候條件、生物及非生物脅迫的影響。全培養(yǎng)周期無(wú)菌環(huán)境控制，無(wú)需使用農(nóng)藥防治病蟲草害的侵?jǐn)_。同時(shí)，植物干細(xì)胞生物反應(yīng)所供給的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分價(jià)格低廉，與哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母細(xì)胞培養(yǎng)體系相比，成本效益更加顯著。

在作為生物合成底盤細(xì)胞方面，植物干細(xì)胞合成植物源天然代謝產(chǎn)物具有先天的優(yōu)勢(shì)。與細(xì)菌不同，植物干細(xì)胞作為真核系統(tǒng)，它們具有正確折疊和組裝多聚體蛋白質(zhì)的能力。此外，植物干細(xì)胞能夠進(jìn)行在許多原核生物中很少發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，為生物合成通路調(diào)節(jié)增添了更多可能性。植物干細(xì)胞在對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行生物合成時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌毒素，合成系統(tǒng)安全性更高。另外，植物干細(xì)胞包含復(fù)雜的內(nèi)膜，能夠順利表達(dá)需定位于質(zhì)體系統(tǒng)的原生生物合成過(guò)程關(guān)鍵蛋白酶。

表1. 不同生物合成底盤情況對(duì)比

植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化方法成熟穩(wěn)定，隨著新基因編輯工具的發(fā)展，異源基因的表達(dá)調(diào)控不再困難。通過(guò)對(duì)代謝途徑的研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物生物合成路線關(guān)鍵基因、限速酶進(jìn)行遺傳操作，提高目標(biāo)產(chǎn)物生物合成量。亦可利用基因工程技術(shù)探索或人工創(chuàng)造全新生物合成路線，獲得本底細(xì)胞地盤品種不具備合成能力的其他目標(biāo)代謝產(chǎn)物。將底盤細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)及目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成能力相結(jié)合，大幅提升產(chǎn)量。同時(shí)，通過(guò)生物反應(yīng)轉(zhuǎn)化作用，能夠?qū)r(jià)值較低的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高價(jià)值目標(biāo)產(chǎn)物。植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)作為解決資源問(wèn)題的有效途徑而成為了當(dāng)代生物技術(shù)的重要發(fā)展領(lǐng)域之一。

圖2. 植物干細(xì)胞生物反應(yīng)

作為生物合成底盤，植物干細(xì)胞展現(xiàn)出了其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)基因或基因編輯工程細(xì)胞并非完整的植株品種，面臨更少的法規(guī)監(jiān)管上問(wèn)題。但是，非模式植物原生干細(xì)胞獲取具有不確定性，高度復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制也給生物合成工作帶來(lái)了前所未有的挑戰(zhàn)。

表2. 植物干細(xì)胞生物催化合成案例[13]

三、植物毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)

植物材料生物反應(yīng)工廠中最常用的生產(chǎn)系統(tǒng)是干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。然而，在特殊情況下，未分化的組織中可能無(wú)法產(chǎn)生某些特定次生代謝產(chǎn)物，或某些植物次生代謝產(chǎn)物的合成高度依賴于特定的組織器官時(shí)，毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)提供了另一種解決方案。毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)是利用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染植物，使植物產(chǎn)生毛狀根。

圖3. 植物毛狀根生物反應(yīng)

該技術(shù)不需外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和額外光源，生長(zhǎng)迅速、分支多、特定次生代謝物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)含量。毛狀根生物反應(yīng)同樣也受營(yíng)養(yǎng)成分、誘導(dǎo)子、前體和基因操作等因素的影響，是目前被認(rèn)為最好的獲得植物次生代謝產(chǎn)物的原材料之一。

表3. 植物毛狀根生物催化合成案例[13]

目前，使用毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)作為生物合成轉(zhuǎn)化的適合材料，正在獲得超越植物干細(xì)胞培生物反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。它們具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括生化和遺傳穩(wěn)定性、對(duì)培養(yǎng)條件變化的敏感性較低、酶潛力與親本植物非常相似和低成本。

四、植物干細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展現(xiàn)狀與研究進(jìn)展

1. 全球產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

多年來(lái)，通過(guò)植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分取得了很大的進(jìn)展。目前已經(jīng)研究過(guò)的植物有400多種，能夠生產(chǎn)超過(guò)600多種的初級(jí)、次級(jí)代謝成分，其中有相當(dāng)大部分具有藥用價(jià)值，部分已成功實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。早在1956年，美國(guó)Routier和Nickell就提出了從植物干細(xì)胞培養(yǎng)合成天然產(chǎn)物的專利[10]。日本三井石油化工公司于1983年宣布將紫草寧作為染料和藥物進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，此外，從毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)地高辛，黃連細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)黃連堿，人參根培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷等均實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。其他如長(zhǎng)春花和彩葉紫蘇等細(xì)胞培養(yǎng)，也達(dá)到中試水平[12]。通過(guò)紅豆杉干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，紫杉醇生物合成量達(dá)到了1045mg/L,較親本植株提升超過(guò)298倍。積雪草總苷類合成量達(dá)到1670mg/g DW,已完全滿足產(chǎn)業(yè)化需求。比利時(shí)Green2chem公司以及法國(guó)Naturex等公司積極利用植物毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了諸如煙堿、西利馬林、紫杉醇、奎寧、佛司可林等20余種高價(jià)值藥用成分的生物合成。在中國(guó)，紐蘭生物將植物細(xì)胞微囊泡作為藥物遞送介質(zhì)開展研究，截至2018年，該公司完成了天使輪融資，已建成噸級(jí)以上植物干細(xì)胞生物反應(yīng)設(shè)備。2022年初，美國(guó)Phyton公司投資30億元在徐州開工建設(shè)PCF植物干細(xì)胞生物反應(yīng)″超級(jí)工廠″，建成后預(yù)計(jì)銷售收入達(dá)70億元。

2. 生物合成助推植物源農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展

不積跬步，無(wú)以至千里。成都新朝陽(yáng)作物科學(xué)股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱″新朝陽(yáng)″）成立二十余年來(lái)，始終專注于農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，是行業(yè)領(lǐng)先的植物源生物農(nóng)藥科技企業(yè)。植物源農(nóng)藥有效成分多為天然高活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，其具有降解速度快、環(huán)境相容性好、低殘留等特點(diǎn)，符合當(dāng)下環(huán)保發(fā)展潮流，市場(chǎng)需求量持續(xù)增長(zhǎng)。但隨著產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，藥用植物資源問(wèn)題即將成為高活性天然產(chǎn)物運(yùn)用的技術(shù)瓶頸。

圖4. 植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)基礎(chǔ)路線

新朝陽(yáng)公司通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)，植物干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，毛狀根誘導(dǎo)等植物干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，開展植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)研究，目前已獲得重要進(jìn)展。

圖5. 基因工程植物干細(xì)胞生物反應(yīng)階段性成果

新朝陽(yáng)通過(guò)植物組織干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，目前已獲得超過(guò)10余種具有生物合成開發(fā)潛力的植物底盤細(xì)胞材料。經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)條件優(yōu)化，目前干細(xì)胞產(chǎn)量已達(dá)到550g/L。通過(guò)基因工程技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)代謝產(chǎn)物的底盤異源表達(dá)，完成了多個(gè)工程細(xì)胞的代謝通路關(guān)鍵基因重組構(gòu)建。并成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生物合成小試技術(shù)研究。為目標(biāo)天然產(chǎn)物品種產(chǎn)業(yè)化技術(shù)目標(biāo)推進(jìn)頂定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

五、植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)展望  

長(zhǎng)期對(duì)珍稀藥用植物的盲目采集致使生態(tài)環(huán)境遭到破壞，許多野生植物瀕臨滅絕，一些特殊生態(tài)環(huán)境下的植物引種困難，能夠引種栽培的植物則需要占用大量的農(nóng)田，在耕地面積日益減少及保證18億畝耕地紅線的制約情況下，藥用植物的大規(guī)模種植受到嚴(yán)重制約。此外，人工栽培受環(huán)境因素的制約，天然植株中目的次生代謝產(chǎn)物含量過(guò)低，成分復(fù)雜又給產(chǎn)業(yè)化利用構(gòu)建了極高的開發(fā)成本壁壘。天然高活性藥用產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手性中心數(shù)量多，傳統(tǒng)化學(xué)合成技術(shù)已無(wú)法滿足生產(chǎn)技術(shù)需求。面對(duì)上述諸多難題，科學(xué)工作者通過(guò)探索高等植物干細(xì)胞、器官等的大量培養(yǎng)技術(shù)，生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物[14-16]，具有極大的社會(huì)意義。

據(jù)《中國(guó)植物源農(nóng)藥行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)狀分析及企業(yè)投資策略研究報(bào)告》顯示，中國(guó)是全球農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，而生物農(nóng)藥（含農(nóng)用抗生素）占農(nóng)藥總量的比例不足12.5%，遠(yuǎn)低于國(guó)際平均水平。生物農(nóng)藥受國(guó)家政策支持，符合當(dāng)下環(huán)保消費(fèi)潮流，市場(chǎng)增速快。植物源農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的關(guān)鍵種類，具備廣闊的發(fā)展前景。

新朝陽(yáng)作為一家從事原創(chuàng)生物技術(shù)研發(fā)的生物農(nóng)藥科技企業(yè)，通過(guò)植物干細(xì)胞生物反應(yīng)技術(shù)的創(chuàng)新突破，致力于解決植物源農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化的瓶頸，為保護(hù)生態(tài)環(huán)境和促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展做出貢獻(xiàn)。未來(lái)，新朝陽(yáng)持續(xù)以作物為科研導(dǎo)向，持續(xù)提升植物源農(nóng)藥的防治效果和降低應(yīng)用成本，推動(dòng)植物源農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展。

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